PROYECTO+CORREGIDO


 * __OBTENCION DE NISINA A PARTIR DE SUERO LACTEO DE QUESERIA MEDIANTE UNA BACTERIA LACTEA__

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA**


 * Contaminacion ambiental por lactosuero:**

La industria láctea en el mundo genera 420 millones de leche en toneladas por año de las cuales 145 mil millones de ton/año corresponden a suero lácteo. La alta capacidad contaminante del suero de leche por su contenido en proteínas y lactosa (materia orgánica) permite la reproducción de microorganismos produciendo cambios en el DBO que varía entre 30,000 a 50,000 mg/l, además de la cantidad de ácido láctico presente va alterar los procesos biológicos que se llevan a cabo en las plantas de tratamiento aumentando los costos. Según estudios realizados en la FAO han demostrado que en una fábrica de queso que procesa 280.000 litros de leche cruda por día, por ejemplo, produce alrededor de 250.000 litros de suero líquido y puede contaminar tanta agua como una ciudad de 50.000 habitantes. En el Ecuador existen 30 empresas industrializadas, se conoce que ALPINA es una de las empresas que ha implementado un sistema de tratamiento de aguas desde el año 2005 y las 250 empresas artesanales de las cuales se desconoce algún tratamiento de los residuos lácteos. En nuestras industrias se produce 444.195 ton/año de lactosuero que es descargado al drenaje y llega a ríos y suelos, causando un problema serio de contaminación alterando sus propiedades fisicoquímicas ya que por cada 1,000 litros de lactosuero genera aproximadamente 35 kg de demanda biológica de oxígeno (DBO) y 68 kg de demanda química de oxígeno (DQO). En el caso de los suelos, disminuye el rendimiento de las cosechas, pero además se observa el fenómeno de lixiviación. Este se presenta porque el lactosuero contiene nitrógeno, convirtiéndose en un peligro para la salud de los animales y humanos. Para el tratamiento de suero lácteo, preferentemente se aplican tratamientos biológicos, para ello se plantean procesos convencionales y no convencionales:
 * 1) **Procesos convencionales**: depuran aguas residuales y no el suero en sí.
 * 2) **Procesos no convencionales**: su objetivo es utilizar el residuo industrial para obtener diversos productos de fermentación, utilizando levaduras y bacterias lácticas en el lactosuero que puede ser utilizado como medio de cultivo para la producción de biomasa, metabolitos (lípidos, alcoholes, ácidos orgánicos, etc.), y enzimas. En este medio la lactosa es la principal fuente de carbono para los microorganismos.

Se describieron por primera vez bacteriocinas como las colicinas producidas por //Escherichia coli// **//(Gratia, 1925)//**, **//Rogers (1928)//** identificó una sustancia de naturaleza peptídica (nisina), producida por L actococcus lactis subsp. lactis que inhibía a microorganismos Gram positivos, incluyendo patógenos y alterantes de alimentos. Se piensa que el 99% de las bacterias pueden producir cuando menos una bacteriocina y la unica razón de que no se hayan aislado es debido a que han sido muy poco estudiadas **//(Gordon y O’Brien, 2006).//** La nisina es la única bacteriocina autorizada como aditivo alimentario especialmente por su actividad frente a los clostridios, reconocida por la FDA. En países desarrollados como Estados Unidos, México, China se está prestando especial interés el aprovechamiento de este residuo, en el Ecuador no se conoce datos de aprovechamiento de suero por lo cual se toma como referencia Alpina-Ecuador que realiza tratamientos de sus líquidos residuales para minimizar la carga orgánica, indicando que un kilo gramo de leche puede obtener 100 gramos de queso y el 90% restante corresponde a suero, contaminando, 2000 veces más que el agua residual doméstica, haciéndola más difícil y costosa para tratar, de esta manera se aprovecha una cantidad de 33.600 toneladas evitando tratar más de 1.507 toneladas de DQO, generando alimentos de valor agregado como lactosa en polvo. **Importancia y Justificación:**
 * ANTECEDENTES**
 * // De Vuyst y Vandame (1994 //** ) citan diferentes generos de microorganismos productores de bacteriocinas dentro de los más empledos, Lactococcus lactis subsp lactis, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Carnobacterium divergens Lactobacillus helveticus, en función de sus características bioquímicas y modo de acción.

El propósito de este proyecto es aprovechar el lactosuero ya que contiene la mayor parte de los compuestos hidrosolubles, el 95% de lactosa, el 25% de las proteínas y el 8% de la materia grasa de la leche, siendo un alimento de enorme desperdicio de nutrimentos. Un aprovechamiento de este desperdicio lácteo se consigue mediante la utilización de bacterias ácido-lácticas que son de importancia en la industria de alimentos, siendo utilizadas para la obtención de ácido láctico, saborizantes, espesantes y **bacteriocinas**, este grupo de microorganismos son empleados en la industria de alimentos para la conservación y mejora tecnológica de los productos lácteos, cárnicos y vegetales fermentados. Los conservantes artificiales presentan problemas para la salud humana, ya que pueden formar toxinas butílicas, por lo que la utilización de nisina como conservante natural es otra importante opción para su obtención. Las bacteriocinas de las bacterias Lac, únicamente la nisina y la pediocina han encontrado aplicaciones comerciales en la industria alimentaria. La Bacteria lactica que produce este antibiotico es el lactococcus, El impacto de este proyecto se enfoca en el aspecto ambiental y educativo; por la reutilización previa de lactosuero cuyo destino final era el desfogue en drenajes y posteriormente a ríos, alternativas de aprovechamiento y elaboración de aditivos alimentarios que aporten con la conservación y alarguen el tiempo de vida útil de los alimentos y promover a la investigación. Los beneficiarios directos de este estudio serán las instituciones interesadas a brindar servicios de remediación ambiental y/o industrias lácteas interesadas en obtener nuevos recursos, los beneficiarios indirectos son los pobladores que mejorarían su calidad de vida y se lograría proteger a la biodiversidad. **Objetivos:**


 * Objetivo General:** Obtener microorganismos lácteos (**//LACTOCOCCUS//**) a partir del lactosuero para la producción de nisina mediante un sistema de bioproceso.

**Objetivos Especificos**
**HIPOTESIS**
 * 1) 1. Aislar y seleccionar microorganismos lactococcus a partir de una muestra de lactosuero.
 * 2) Adaptar un proceso con un sustrato fermentable (lactosa) para el desarrollo de lactococcus.
 * 3) Preservar el microorganismo lactococcus mediante crioviales con glicerol al 20%.
 * 4) Propagar el crecimiento de lacctococus para producir biomasa y el metabolito nisina
 * 5) Comprobar el efecto bacteriocina de la nisina en alimentos contaminados con microorganismos patógenos y alterantes del genero gram positivos.

**Hipotesis nula:**
No se obtuvo microorganismos (**lactococcus** ) a partir de lactosuero para la producción nisina.

**Hipotesis alternativa**
Se obtuvo microorganismos (**lactococcus** ) a partir de lactosuero para la producción de nisina. **ALCANCE:** Este proyecto abarca la obtención de microorganismos lactococcus a partir del aislamiento, selección, adaptación, preservación y propagación para producir bacteriocina (nisina). **MARCO TEORICO** || ** LACTOCOCCUS LACTIS ** || Reacciones de Oxido-Reducción a partir de compuestos orgánicos. || Compuestos Orgánicos: Lactosa
 * ** BACTERIA ** || ** FUENTE DE ENERGIA ** || ** FUENTE DE CARBONO ** || ** CATEGORIA ** || ** GRUPO ACEPTOR DE ELECTRONES ** || ** METABOLISMO **

|| ** QUIMIORGANOTROFOS ** || La lactosa del suero de queso sirve como donador y aceptor de electrones. Se da un proceso de FERMENTACION en que la Oxidación es parcial de los átomos de carbono presentes en la lactosa. || FERMENTACION catabolismo anaeróbico. Homofermentativas. Auxotrofo Son anaerobios aerotolerantes ya que carecen de catalasa, poseen peroxidasas y superóxido dismutasas que destruyen el H 2 O 2 y el O 2 - que se forman en condiciones de aerobiosis. Produce un grupo de antibióticos polipeptídicos llamados nisinas. || ** NISINA ** || Es muy eficaz como conservador frente a bacterias Gram-positivas. No es eficaz con las bacterias Gram-negativas. Es capaz de impedir el desarrollo de //[|clostridios] y [|bacilos]//, destruyendo la pared de la //[|espora]//. La sensibilidad a la nisina varía de unas bacterias a otras. La dosis mínima de eficacia no es siempre la misma. || En la síntesis de la nisina participan un grupo de genes ordenados como //nis//ABTCIP, //nis//RK, y //nis//FEG que regulan la expresión del gen estructural //nis//A. El precursor inactivo NisA es modificado químicamente por los productos de nisB y nisC que deshidratan a los residuos de treonina y serina y originan la formación de los enlaces tioeter característicos de los antibióticos. Una vez modificado el precursor, este es transportado, procesado y secretado; para proteger a la célula productora, existen las proteínas NisL y NisFEG que le confieren inmunidad. || = =
 * ** BACTERIOCINA ** || ** ESPECTRO DE ACCION ** || ** FORMACION DE LA NISINA **
 * (A PARTIR DEL METABOLISMO DEL LACTOCOCCUS) ** ||

**cinetica de crecimiento de lactococcus**
**Gráfico.1**

**cinetica de produccion de nisina**

 * Gráfico.2**

En la grafica.1 muestra una tendencia de crecimiento exponencial del lactococcus teniendo como referencia una tasa de crecimiento de (µmax =0.523h-1) y un tiempo generacional de (tg =1h) cuyo tiempo transcurrido es cada 5 horas, partiendo de una concentración inicial de1x102ufc/ml.

El Lactococcus es un microorganismo auxotrofo capaz de fermentar la lactosa y producir altas cantidades de acido láctico, ya que contienen un complejo proteolítico que les permite hidrolizar la caseína, este exige un suministro exógeno de aminoácidos para su crecimiento, siendo incapaz de efectuar su síntesis a partir de una fuente nitrogenada mineral simple. Es capaz de producir algunas substancias antibacterianas entre las cuales destacan la nisina.

En la gráfica 2 existe una comparación entre el medio M17 y lactosuero donde sigue la misma tendencia en ambos medios. Sin embargo, el pH disminuyó hasta alcanzar valores de 4.2 en el cultivo crecido en suero de quesos mientras que en M17 se estabilizó en 5.5.

La producción de nisina en ambos medios aumenta progresivamente a lo largo del crecimiento del lactococcus. No obstante, en los dos medios existe una disminución de los niveles de actividad una vez que las células alcanzan la fase estacionaria, formando el metabolito secundario (//nisina//). **MARCO METODOLOGICO**
 * MUESTREO**

El experimento se realizara en laboratorio de microbiología de la Facultad de ciencias químicas con muestras de suero lácteo obtenidas de la fábrica de quesos La Andina en Machachi Ecuador. Las muestras de suero lácteo serán escogidas totalmente al azar y serán empacadas en bolsas herméticas selladas y guardadas en una cooler, con hielo para mantener la muestra fresca, una vez en el Laboratorio se mantendrán en refrigeración hasta los análisis. El tiempo trascurrido entre toma de muestra y análisis es de un día


 * TECNICA DE AISLAMIENTO PARA LACTOCOCCCUS.**

Se toman 10ml de suero lácteo con 90 ml de caldo M17se debe incubar en condiciones de anaerobiosis a 37ºC por 72horas en una estufa, para adaptar a los microorganismos que se encuentran dañados o debilitados. Realizar diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-4 .Tomar el tubo de la dilución menos concentrada y sembrar por estriado en superficie con el medio selectivo y diferencial M17 agar por duplicado, las cajas se incubaran a 37ºC por 48 horas, manteniendo las condiciones de anaerobiosis. Realizar una resiembra con el mismo medio selectivo y diferencial M17 agar por duplicado para obtener cepas puras. Para comprobar la pureza del cultivo, las colonias deben aislarse nuevamente en un medio no selectivo como agar nutritivo a una temperatura de 37ºC por un día con el método de estrías, ya que en el medio selectivo M17 puede ocurrir que una colonia característica del microorganismo que estamos buscando pueda contener como contaminantes en muy bajo número otros microorganismos que no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer.
 * REVIVIFICACION:**
 * AISLAMIENTO**

Se debe tomar las colonias que muestran distinta morfología en función tamaño, forma, borde, elevación, transparencia, color y velocidad de crecimiento. 
 * SELECCIÓN**

A los lactococcus seleccionados se procede a pasar a suero de quesería pasteurizado suplementado con caseína hidrolizada obteniéndose mejores resultados de producción de nisina a una concentración de 15g por litro y a un pH menor de 5 después de 24 horas de fermentación según el Centro de Estudios y de Investigación en Biotecnología (CIBIOT) Colombia. 1. Tarar cajas (105ºC) y enfriar en desecador 2. Inocular cepas en medio liquido 3. Previo a incubación retirar 5 ml para obtener blanco 4. Prepara inoculo concentración 1x102cel/ml sembrar 24h 5. Retirar 5ml del inoculo inicial y filtrar, para obtener peso seco. 6. Incubar a temperatura a 30ºC en anaerobiosis cada cepa 7. Por cada cierto tiempo retirar 5ml de suspensión y filtrar 8. Colocar el filtro en cajas y colocar en una estufa 105ºC 9. Retirar la caja, enfriar y pesar. Un método comúnmente utilizado para estudiar la acción antimicrobiana es el método de difusión en agar.
 * ADAPTACIÓN**
 * La **determinación de la biomasa** se realizó por peso seco:
 * La **actividad de la nisina** se evaluó por difusión de agar:

1. Preparar una placa que contenga un medio con agar 2. Inocular de forma uniforme con el organismo control (listeria monocytogenes) 3. A continuación se colocan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes antibióticos. 4. El antibiótico difundirá desde el papel filtro al agar en forma radial. 5. Se incuba la placa por 18/24 horas a 37ºC (respetar este parametro, porque temperaturas menores pueden disminuir la velocidad del crecimiento del germen y la difusion del antibiotico dando halos irregulares.)

Las cepas de Lactococcus aisladas se transfieren a caldo BHI con glicerol (40% v/v) y se congelaron a -80 ºC hasta su posterior análisis.
 * PRESERVACION**


 * FACTIBILIDAD**

**BIBLIOGRAFIA**


 * []
 * []
 * []
 * []
 * []
 * []
 * []
 * http://viaclinica.com/article.php?pmc_id=1182390
 * http://digital.csic.es/bitstream/10261/8416/1/bea%20tesis.pdf
 * []
 * http://books.google.com.ec/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA190&lpg=PA190&dq=importancia+de+lactococcus+lactis+%2B+METABOLISMO&source=bl&ots=_oBa6jBDDc&sig=F0LzZqlfnqhthoUVzThC29S4TQ&hl=es&ei=qBAGS9zxAYzHlAfChqWnDA&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=10&ved=0CCMQ6AEwCQ#v=onepage&q=importancia%20de%20lactococcus%20lactis%20%2B%20METABOLISMO&f=false
 * http://www.expoinnovaquimica.com/sitio/docs/memorias/posters/EVALUACION_DE_LA_PRODUCCION.pdf
 * []
 * []
 * []
 * · GARCÍA GARIVAY, QUINTERO RAMÍREZ Y LÓPEZ MUNGIA. Biotecnología Alimentaria. Editorial Limusa. Pag: 316-317.
 * · http://www.pncta.com.mx/pages/pncta_investigaciones_04g.asp?page=04e3
 * · http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0798-22592009000200015&script=sci_arttext
 * · http://www.universia.com.ar/contenidos/investigacion/unl/TECNOLOGIA/cs_alimentacion/648.htm
 * http://journal.paho.org/?a_ID=587
 * Berruga Fernández, María Isabel; San Jose Serran, Carmen (Directed by). Desarrollo de procedimientos para el tratamiento de efluentes de quesería. España: Universidad Complutense de Madrid, 2005. p 24. [] Copyright &copy; 2005. Universidad Complutense de Madrid. All rights reserved.
 * Fernández Dumont, Antonio; Rodríguez Gómez, Juan Miguel (Contributor). Producción inducible de lactococina A, pediocina PA-1, colicina V e interleuquina-2 en cepas de "Lactococcus lactis" productoras de nisina., España: Universidad Complutense de Madrid, 2006. p xcix. [] Copyright &copy; 2006. Universidad Complutense de Madrid. All rights reserved.
 * Cortada, Arelys; Rodríguez, Oxalis. Principales métodos de conservación de leches fermentada. Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008., Cuba: Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia, 2009. p 4. []. Copyright &copy; 2009. Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia. All rights reserved. [] http://www.universia.com.ar/contenidos/investigacion/unl/TECNOLOGIA/cs_alimentacion/648.htm


 * CRONOGRAMA**


 * Nota:** Para observar las graficas, factibilidad y cronograma dirigirse al documento adjunto. gracias.